主题：【原创】青蒿素抗疟小记1 -- Silvia

对大家的鼓励深表感谢。新手挖的坑不深，我争取今天就填完。

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六十年代越南战争正进行得如火如荼。交战双方都意识到一个重大的问题：真正倒在枪林弹雨中的士兵远没有因为疟疾而失去战斗力的人数多。这里的疟原虫已经对当时的特效药氯奎产生了抗药性。美国军方财大气粗，不惜工本，筛选了20多万种化合物，也没有找到理想的结果。而越南饱受战争之苦，民贫国弱，只好向中苏求援，研制新的抗疟药。

经周恩来总理批示，1967年5月23日国家科委、解放军总后勤部在北京饭店召开了“疟疾防治药物研究工作协作会议”。由国家科委、卫生部、化工部、总后勤部、国防科工委和中国科学院组成了全国疟疾防治领导小组，国家部委、军队直属和10个省、市、自治区及有关军区的数十个单位组成攻关协作组。从此拉开了抗疟新药研制的序幕，项目代号也因此定名为5.23。协作组的科研人员在总后卫生部长的直接领导下、成立了以张剑芳任副主任、周克鼎任秘书的常设机构——5.23办公室。在办公室的统一部署下，组织医药科研、医疗、教学、生产等专业的500多名科研人员，从生药、中药提取物、方剂、奎宁类衍生物、新合成药、针灸等六个大方向寻求突破口。

从选取的研究方向可以看出，项目协作组一开始就把研究重心放在了传统的中医药上。这显然符合当时中央扶植提倡中医的政治气氛。不过也正是这一大方向，在很大程度上保证了最后的成功，没有重蹈美国人的覆辙。因为一方面，研究的思路避免了“抗疟药必须含氮杂环”错误论断的影响。另一方面，又可以充分利用中医药抗疟几千年来的知识积累，可算是以知识进化PK自然进化。

中医拥有浩繁的医书典籍和大量的民间偏方验方。几千年来积累的不仅有精华，还有大量的糟粕。因此如何去伪存真、辩本清源，选准研究方向，是非常重要也非常艰难的。为此各研究组在1967至69年间筛选了4万多种抗疟疾的化合物和中草药，但没有得到令人满意的发现。

1969年1月21日，北京的卫生部中医研究院参加5.23项目，任命屠呦呦为科研组长。屠呦呦1955年毕业于从北京医学院药学系，分配在中医研究院中药研究所工作。1959年参加“全国第三期西医离职学习中医班”两年半，系统地学习了中医药知识。她参加过中草药半边莲和银柴胡的研究工作，对中药材及其炮制技术有丰富的经验。接受任务后，屠呦呦首先从系统收集整理历代医籍、本草入手，并收集地方药志及中医研究院建院以来的群众来信，寻访老大夫总结实际经验等，汇总了植物、动物和矿物等2000余种内服外用方药，从中整理出一册《抗疟单验方集》，包含640多种草药，其中就有后来声名远扬的青蒿。不过，在第一轮的药物筛选和实验中，青蒿提取物对疟疾的抑制率只有68%，还不及胡椒有效果。在其它科研单位汇集到5.23办公室的资料里，青蒿的效果也不是最好的。在第二轮的药物筛选和实验中，青蒿的抗疟效果一度甚至只有12%。因此，在相当长的一段时间里，青蒿并没有引起大家的重视。

青蒿在民间俗称臭蒿或苦蒿，属菊科一年生草本植物，在中国南北方都很常见。古代多部中医药典都有关于青蒿可以治疗疟疾的记载，很多地方的民间土药方也都用青蒿来对抗疟疾，并且收效显著。为什么在实验室里青蒿的提取物不能很有效地抑制疟疾呢？

前面提到中医典籍中错谬很多，首先传统中药青蒿包括有两个品种，学名为黄花蒿的具有抗疟作用，而学名青蒿的没有任何抗疟作用。其次中药常用煎熬等高温方法配制，有的医书中竟有将青蒿与鳖甲一块熬汤治疗疟疾的记载。实际上，青蒿素在温度高于60度时就完全分解了。这种鳖汤不可能对疟疾有任何治疗作用。

屠呦呦重新把古代文献搬了出来，一本一本地细细翻查。东晋葛洪《肘后备急方》中的几句话吸引了她的目光：“青蒿一握，水一升渍，绞取汁服”，可治“久疟”。屠呦呦细细琢磨这段记载，觉得里面大有文章，很有可能高温破坏掉了青蒿的有效成分。她立即改进了提取方法，用沸点较低的乙醚进行实验。终于在1971年10月4日，第191次实验中，屠呦呦观察到青蒿提取物对疟原虫的抑制率达到了100%！在其后的实验中，她又进一步将提取物区分为中性物（青蒿素）和酸性物（青蒿酸），并发现中性提取物抗疟效果好且毒性小，而酸性提取物对疟疾无效且毒性大。1972年3月8日，在南京全国抗疟研究大会上，屠呦呦首次报告这一实验结果，全场振奋，并要求当年即上临床，以观察实际疗效。1972年8月至10月，屠呦呦携药去海南昌江疟区，首次将青蒿中性提取物用于临床，从本地人口到外地人口，从间日疟到恶性疟，取得了30例的满意疗效。但因为工艺不稳定，这种粗提取物混杂有其他物质，存在着药理毒性大等缺点。

无独有偶，山东省中医药研究所的魏振兴也几乎在同时进行着青蒿素的提取工作。魏振兴1952年毕业于齐鲁大学药学系，分配到济南市卫生实验所工作，负责药品检验。1953年以卫生实验所为基础成立了济南市药品检验所，后又改为山东省药品检验所。在此期间，一直任所技术行政负责人。1956年9月调往山东省卫生厅实验药厂负责中药研究。1958年7月和中药研究的全部人员一起成立了山东省中医药研究所，任药物室负责人。1969年10月25日山东省中医药研究所参加5.23项目，魏振兴出任山东省的课题负责人。

在博览中医典籍的过程中，魏振兴也注意到了青蒿的抗疟功效。几经斟酌，他决定选取山东本土生长的黄花蒿作原料，试图提取其中的有效成分。但这一想法与研究所上层的想法相左，他们认为中药的抗疟功效是来自于多种草药的复合作用。因为坚持自己的观点，魏振兴还被关进了牛棚。即使这样，他仍不改初衷，用济南千佛山的黄花蒿叶榨汁，取得了抗疟的初步效果，证明这种想法值得一试。随后为了提高产量，研究组用水煮法提取汁水给疟疾患者服用，这显然不会有什么效果。经过无数次失败，研究组决定改用有机溶剂进行直接提取，先后试用了酒精、乙醚、丙酮等介质，虽然提取物对实验小白鼠有一定疗效，但因含有树脂、叶绿素等杂质，黑乎乎的一团，弄不清是哪种成分在起作用。直到1971年，研究人员采用醋酸乙酯等作介质提取到了白色结晶体，但结晶体仍存在熔点不固定、纯度不够等问题。后来，研究人员通过重新结晶，得到了纯度达99.9%的结晶体，测得熔点为156度。当年条件非常艰苦，为了验证提取物的毒性，魏振兴竟还亲自服用。由于研究人员在极其简陋的实验室里用极其落后的仪器设备，采用挥发性的介质进行药物提取结晶实验，实验室有一天突然发生大火，整个实验楼顶层楼板爆裂，烈焰冲天，消防队派来了5辆消防车，才最终将惊心动魄的大火扑灭。即便是这样，研究组的工作也一直没有停顿。

1973年，山东中医药研究所的提取工艺日趋成熟，并且获得了提取温度不得超过60度，否则有效成分就会被破坏的核心数据。同年，他们和山东省寄生虫病研究所在巨野对黄花蒿的提取物进行了临床试验。观察结果表明：黄花蒿制剂对间日疟原虫具有较强的灭杀效果，临床作用迅速，而且最重要的是未见明显的毒副作用。这比起前一年海南的临床试验前进了一步。为了交流经验，11月全国5.23办公室的施凛荣和北京中医研究院的蒙光容来到济南详细了解山东的研究成果。蒙光容与魏振兴特别对青蒿素的心脏毒性和提取工艺的温度问题进行了深入的讨论。魏振兴毫无保留地介绍了他们的提取方法及药理实验研究等情况。他还通过这些北京来的专家，将12克晶体分头送给上海有机化学研究所等多家科研机构，进行化学结构分析。

第三家从事青蒿素提取工作的单位是云南省药物研究所。与前两单位相比，他们的青蒿素之路充满了巧遇。1972年年底，云南5.23办公室主任傅良书从北京带回一个消息，说中医研究院发现青蒿的粗提取物中含有一种可能会对疟疾有效的成分。1973年新年，罗泽渊在云南大学校园里意外地发现了许多同属的苦蒿。抱着试一试的想法，她采了一大把回来，制备了不同溶剂的提取物并顺利地获得了数种结晶体。从事药效学筛选工作的黄衡惊讶地发现编号为结晶体三的化合物能彻底杀灭小鼠血片中的疟原虫。经过进一步的药效学、药理学研究，到3月底，研究组证实了三号结晶体确实具有高效、低毒抗鼠疟的特点。与此同时，苦蒿的植物标本经分类专家吴征镒鉴定，定名为菊科蒿属大头黄花蒿。因此，他们将该结晶命名为黄蒿素。

发现优质酉阳黄花蒿的经过更是偶然。由于晾晒时不小心，药物所在昆明采集的黄花蒿叶子全掉光了，只剩杆。而杆的提取物是没有抗疟成分的，有效成分主要是在蒿叶里。这时昆明的节气已过，为了找到更多的黄花蒿，戚育芳想到了四川的花期比云南晚。于是她和詹尔益马上赶赴重庆，在市医药公司买下了500公斤正准备处理掉的不合格的黄花蒿，回到所里加工提取。研究组意外地发现这批蒿中的黄蒿素含量比大头黄花蒿高出10倍以上。经查证，这批黄花蒿的产地为四川酉阳。后来全国青蒿普查时，发现这里的平均含量高出全国两倍，家种的更高达16‰~19‰。1987年国家安排魏振兴到酉阳建武陵山制药厂，自行设计建造了世界第一个吨级的全自动青蒿素提取生产线。现在该厂已成为当地重要的财政支柱。这是后话。

有了优质的原料，药物所很快就累积了一定数量黄蒿素。同年，研究组长梁钜忠带上样品到北京开会。红外光谱的测试数据证实北京、山东和云南的三个样品为同一种化合物，并在此次会议上依从中药的名称，正式将该化合物定名为青蒿素。

云南药物所再接再厉，试验了丙酮、氯仿、甲醇、苯、乙醚等多种有机介质，进行了几十次的改进，终于在1974年初，发明了汽油提取法。该法以其稳定可靠、操作简便、流程短、经济合理、收率高、产品易纯化、有利于工业生产等特点，在全国引起轰动。其后，研究组通过上百次试验和31批中试，完善了生产工艺，制得青蒿素30余公斤。当年9月，药物所将数百克青蒿素制成片剂，由黄衡和陆伟东奔赴恶性脑疟的高发区云南耿马进行临床试验。他们与从广东中医学院来的李国桥合作，做了21例临床试验，证明青蒿素对治疗最凶险的恶性疟有着非同寻常的作用，仅仅0.2克结晶物能象炸弹一样消灭体内的疟原虫。

至此青蒿素作为一种新的抗疟药，已被证实功效卓著，具有高效、速效、低毒的优点。但它的缺点也很明显：不溶于水和油，只能做油溶混盐剂，生物利用率低，不利于对疟疾病人的抢救；杀虫不彻底，治疗周期长，剂量大，复燃率高。成功提取青蒿素，只是万里长征第一步。我们还必须了解青蒿素的化学结构，以便对它进行更好的改进。

1974—76年，中国科学院生物物理所和上海有机所合作，结合化学光谱数据，运用X光衍射方法最终确定了青蒿素的立体化学结构和绝对构型。青蒿素是含过氧基团的倍半萜内酯，其分子结构为一组过氧桥被一个环状结构所保护，分子式为C15H22O5。这是一个与以往抗疟药化学结构完全不同的新结构，打破了“抗疟药必须含氮杂环”的传统论断。青蒿素神奇的抗疟作用的关键就在于过氧桥。疟原虫破坏人体的红细胞，体内含大量的铁。青蒿素能被疟原虫体内的铁所催化，其结构中的过氧键裂解，产生自由基。自由基与疟原虫蛋白发生络合，形成共价键，使疟原虫蛋白失去功能，从而导致疟原虫死亡。这是一个全新的抗疟机理，因此能有效地杀灭已经对奎宁类药物产生抗药性的疟原虫。

含过氧桥的化合物在以往的药物研究中从未引起过科学家的注意，因为这种结构非常不稳定，暴露在空气中就会分解，更别提进入人体发挥药效了。但青蒿素结构的神奇之处在于，它的过氧桥是被一环状结构保护着，使其足够稳定地进入人体，发挥作用后又能很快地分解掉，从而减少疟原虫产生抗药性的可能性。我们不得不由衷地惊叹大自然的精妙绝伦。这也是中草药和动植物药学的独到之处。人脑的凭空想象是远不能与自然的神奇相媲美的，要不怎么说，真实的社会生活远比最好的小说还要精彩。事实上，青蒿素开启了一扇神奇的大门，这类化合物除了对疟疾、血吸虫等寄生虫病有效外，还有免疫抑制的作用，有望用于红斑狼疮、类风湿等病症的治疗。并且，在抗肿瘤活性方面也有了比较乐观的结果。这极大地开阔了药物研究的视野。

成也萧何，败也萧何。青蒿素的环状结构保护了过氧桥的稳定，但也造成青蒿素难溶于水和油，不易制成适当的剂型，使用不方便，生物利用率低。因此，在弄清楚青蒿素的分子立体结构以后，5.23协作组提出了新的科研课题，对青蒿素结构进行化学修饰，研制功效更好的第二代青蒿素类药物。

上海药物所的李英等经过各种药理试验，合成了脂类、醚类、碳酸脂类三种青蒿素衍生物。它们的抗疟活性均比青蒿素高。经临床研究证实，其中的蒿甲醚不仅保持了青蒿素原有的高效、速效、低毒的特点，而且能使复发率有所降低(约8%)，在治疗抗氯奎恶性疟和凶险型疟疾方面具有确切的疗效。更重要的是它油溶性很大，可以制成针剂，对抢救危重疟疾病人非常有利，蒿甲醚于1981年通过鉴定，1995年载入国际药典，现已被世界卫生组织列为治疗凶险型疟疾的首选药，并且为日后研制的更加高效的抗疟新药——复方蒿甲醚，提供了坚实的基础。

广西桂林制药厂于1977年5月21日开始做青蒿素的结构改造。研究人员发现可以把十位羰基还原成羟基，变成还原青蒿素，在此基础上可以进一步制成酯和醚，也可以做成碳酸基青蒿素。5.23协作组把桂林制药厂开发的13个衍生物拿到广西医学院做药效筛选，同时在广西寄生虫研究所做临床试验。经过筛选和临床试验发现，以刘旭发明的804衍生物（以其室验室命名）可解决水溶性的问题，且疗效提高5倍,这就是青蒿琥酯。

中医研究院中药研究所屠呦呦1973年制得还原青蒿素，由此确证青蒿素结构中羰基的存在。又从1985年以来，经七年研究，按一类新药评审要求，将其完善成双氢青蒿素，并于1992年7月获得新药证书。双氢青蒿素抗疟疗效高于青蒿素10倍，能以口服途径给药，而且复燃率明显降低。通过临床比较，口服双氢青蒿素片杀虫速度能赶上静脉注射的青蒿琥酯，优于肌肉注射的蒿甲醚。

此外，青蒿素的衍生药物还包括WHO与美国军方合作研制的蒿乙醚，和香港科技大学Haynes研制的青蒿砜等。这些虽与5.23项目协作组没有关系，但都是在中国公开青蒿素的相关研究成果以后，以此为基础所开发的单方类青蒿素药物。

青蒿素来源于中草药，生产基本上依靠人工栽培。从种植青蒿，提取青蒿素到最后制得成药，整个生产周期长达14个月。除了产量难以满足需求，质量也难以控制外，青蒿素的价格远高于传统抗疟药物。对生活在疟疾肆虐的贫穷地区的患者来讲，这几乎是一个致命的弱点。很自然，大家都想到了人工合成。就象当年在弄清楚了奎宁的化学结构和作用机理的基础上，人工合成了阿的平，从而实现能够快速价廉的大量生产。

青蒿素的化学合成可分为半合成和全合成。所由谓半合成，是指由青蒿酸为起点，人工化学合成青蒿素。虽然仍然依赖青蒿的种植，但由于青蒿叶中青蒿酸比青蒿素多十倍，这不失为一种权宜之计。上海有机所许杏祥、周维善等人在1983年完成了青蒿素的半合成。反应的关键是合成烯醇甲酮酸甲，总反应经8步完成。这一方法直到1992年才被Acton和Roth大大改进，反应历程缩短为3步：用NaBH4或NiCl氢化还原；光氧化过程；空气氧化过程。产量也比前一合成路线提高32%，大大提高了提取植物中青蒿素的产量。

1984年许杏祥等人又完成了青蒿素的全合成。他们从香草醛起步，先合成青蒿酸，后通过半合成制得青蒿素。反应步骤为20步，产率为0.25%。Schmil等也报道了一条全合成路线，反应以异薄勒醇为原料，保留原料中的六元环，环上三条侧链烷基化，形成中间体，最后环合成含过氧桥的倍半萜内酯。反应经13步完成，总产率为2.1%。到1992年，Averty等以薄勒醇为原料，中间体与前两种反应相似，较之前两者的优点是产物为单一的立体异构体。步骤为10步，产率为3.6%。全合成反应在产量上大大高于人工栽培，但技术难度很大，产率已很难提高。相对来说，半合成工艺在大批量生产上更有潜力。

除了化学合成，现在的研究人员还想到了遗传工程。2004年美国加州大学伯克利分校的Jay Keasling等人将黄花蒿中新发现的一种完成青蒿酸合成的酶的基因植入酿酒用的酵母菌，酵母便能制造出青蒿酸来。结合半化学合成法，这一新方法为最终实现青蒿素的全工业化生产展现了一线曙光，虽然这一方法的真正运用还有待时日。

另外，美国和印度的制药厂从青蒿素过氧基杀疟机制中得到启示，正在人工合成含过氧基的化合物。其中如何平衡过氧基的稳定性和药物的水溶是一个十分有挑战性的难题。目前比较有潜力和代表性的是OZ-277和DB289。但它们都未通过临床第二期试验，仍然需要做大量工作。

疟原虫的抗药性是所有抗疟药绕不过去的话题，青蒿素也不例外。过去的经验显示，疟原虫产生抗药性的速度出乎人们意料地迅速，磺胺胍嘧啶、氯奎分别在广泛使用5、6年后便因产生抗药性而疗效大幅降低。具有全新化学结构和作用机理的青蒿素的前景会怎样呢？对此专家们有两种截然相反的看法。

李国桥等人认为：青蒿素不同于化学合成药物，是从天然植物中提取，半衰期极短，不会促进抗药性产生。从历史的角度来看，植物中提取出来的奎宁直到今天还是比较有效的抗疟疾药物。而氯奎、甲氟奎等化学合成药目前已经产生了极大的抗药性。由此可推想，青蒿的使用寿命不会短于奎宁。中国从1981年开始大量使用青蒿素类药物，越南从1990年也开始大量使用。直到今天，还未观察到疟原虫产生抗药性的明确证据。按照通常理论，一个药物使用10年后没有明显的抗药性，表明其产生抗药性是比较难的，更何况如今使用已经超过了25年。军事医学科学院的研究结果表明，用老鼠做实验，实验200代后，青蒿的抗药指数不超过10，是非常低的；而西方国家的化学抗疟药用老鼠做实验，实验30代，其抗药指数就高达300。

而另一方面，2005年发表在著名医学杂志《柳叶刀》上的一篇文章报道了，在法属几内亚和塞内加尔的受试者的血样中发现了疟原虫已经对青蒿素类药物产生抗药性的迹象。而伦敦大学的研究也表明，只须改变一个氨基酸，疟原虫就能对青蒿素产生完全的抗性。这大大加重了人们的担心。

不管怎么样，小心总不是坏事，特别是对青蒿素这么重要的最后防线来说。一旦青蒿素类抗疟药因抗药性而失去治疗作用，人们对于那些徘徊在生死边缘的患者将无计可施。此外，在找到新的药物或免疫方法之前，人类还指望青蒿素能够多坚守一段时间。

军事医学科学院微生物流行病研究所的周义清、宁殿玺根据“复方是克服或延缓抗性产生的有效方法之一”的信息，率先将蒿甲醚和本芴醇配伍使用，在组方配比上进行大量试验，最终研制出首个固定配比的青蒿素类复方抗疟药——复方蒿甲醚。本芴醇也源于5.23项目，是周义清的同事邓蓉仙、滕翕和等人在70年代初开发的一个新化学结构药，具有半衰期长，杀虫彻底的优点，但易产生抗药性。蒿甲醚和本芴醇的组合不仅扬二者之长，避二者之短，而且大大延缓了疟原虫抗性产生。研究证实，同样是在用药140天、培养20代之后，疟原虫的抗性指数在单独使用蒿甲醚或本芴醇时分别为6.4和205.0，而复方蒿甲醚仅为2.8。

着眼于降低成本，提高疗效，广州中医药大学李国桥等人也推出了双氢青蒿素与哌奎的复方Artequick。这个新药不仅疗效快、治愈率高，而且只需两天疗程，每天服药1片，因而总的价格仅为同类药物一半，非常适合贫困地区的患者使用。因此受到WHO的关注。目前，青蒿素类复方抗疟药还有军事医学科学院王京燕研发的青蒿素与萘酚奎复方，上海寄生所研究的青蒿琥酯与咯萘啶复方。国内企业也在此方向积极跟进，比较有名的产品有昆明制药的Arco（青蒿素和萘酚奎），华立的阿特健和科泰复（双氢青蒿素和哌奎），通和制药的安立康（双氢青蒿素和哌奎）和桂林南药（上海复星）的青蒿琥酯与阿莫地奎或乙嘧啶-周效磺胺SP组成的复方。在境外，法国赛诺菲公司与被忽视药物研发行动(DNDi)组织联合开发了青蒿琥酯与阿莫地奎的固定比例ACT药物，韩国企业也正在开发的青蒿琥酯和咯萘啶复方。需要指出的是，这些与青蒿素复方的化学合成药物中，除阿莫地奎和周效磺胺是五十年代开发的外，哌奎，咯萘啶，萘酚奎和本芴醇一样，都是青蒿素的表兄弟，源于5.23项目的成果。

正是中国40年前开始的抗疟药研究大协作项目，发现了当前全球最有效的治疗和控制疟疾的药物，创造了中国医药史上闪亮的一页。青蒿素类抗疟药就象一道坚实的城墙，让人类在与疟疾的斗争中，暂时保住了一个安全的立足点，为新药品和新方法的诞生争取了宝贵的时间。老一辈科学家们“看事业重如山，视名利淡如水”，在艰苦的条件下创造了怎么评价都不为过的伟大历史功绩。尽管没有显赫的奖项（最高为1979年获得的国家发明二等奖，获奖单位排名为卫生部中医研究院、山东省中医药研究所、云南省药物研究所、中国科学院生物物理研究所、中国科学院上海有机化学研究所和广州中医学院），绝大多数参加者也只是过着平淡的晚年（只有周维善后来评为院士），但“如果没有你们，更多人将死去”。