主题：超精细光学显微镜 -- chela

2006德国未来奖：超精细光显微镜

从17世纪以来科学家就使用光显微镜来看肉眼看不清的东西。但要看清细胞内部，光显微镜就太弱了。原因是光阻挡了视线。大约15年前，德国物理学家施台凡.黑尔就说这个问题是可以解决的，但没人相信他。现在他果然造出了这样的显微镜，因而获得了2006未来奖。这是对光学作出的重大贡献。

1873年，现代显微学之父，耶拿的教授恩斯特.阿贝（Ernst Abbe）已经发现：“一台显微镜只能显示长于半个波长的东西，也就是说至少在五千分之一毫米以上。小于这个尺寸的就模糊了。”而哥廷根的马科斯.普朗克生物物理研究所所长斯台凡.黑尔（Stefan Hell）2006年说：“我早就感觉到，这里面有文章可做。”

阿贝说：“光在镜片里折射，这限制了分辨率。我的相关公式在每一本教科书里都有。”黑尔说：“假如有兴趣去了解界限的本来原因，人们就能学会推移这个界限。”

斯台凡.黑尔推移了这个界限。他的光显微镜能够显示小于五千分之一毫米的东西的细节，而且不是模糊的，而是清晰的。他自豪地展示他的研究成果。在前室里，这位所长跟别人一样换鞋。给来访者备有套穿鞋。

来宾一个接一个地穿过一扇窄窄的转门。黑尔说：“这是一道光闸，是为了让研究人员可以在黑暗中工作。否则，如果门被人打开，光线会导致测量错误。”

里面是漆黑的。除了空调的声音，也是寂静的。角上两台电脑屏幕发着微光。一张象台球桌大小的桌子几乎占满了这个房间。桌上散放着光学组件，至少有二十几件，构成一个由镜片、镜子和反光板组成的迷宫。桌子的一端射出一道激光。

黑尔说：“这么放也是为了让人们能够明白物理原理。这必须通过一个敞开的系统来做，因为必须让人看到，假如我在这里改变什么，会发生什么事。这里成为一个系统，有镜片，镜子和其它东西，直到最后面的激光。”

基础是一台荧光显微镜。这几十年来就是细胞研究方面的标准工具。比如，谁想看一个细胞里的蛋白质，就沾上一点荧光颜料。光线照上去，有色的光就会显示蛋白质所在。但是，所有小于200纳米的东西，都显得模糊不清。直到斯台凡.黑尔天才地想到：荧光分子可以被激强，为什么就不能被激弱呢？

为做到这一点，他需要两个不同的激光频率：“比如我们取一道蓝色的激光来激强，这是高能光，用一道低能的光比如黄光来激弱。我们把这道激弱光掺合在激强光里，两道光同时打在一个对象上，一道是正常的聚焦的光柱，一道是这环型的光柱。这么一来，中间放光的就只剩下很少一点了，理论上可以使这块荧光斑点变得任意的细小，这是本质上的新的地方。”

斑点越小，分辨离率越高。现在甚至可以看见细胞内部只有20纳米大的部位。虽然电子显微镜或光栅扫描探头显微镜也可以做到这点，但在它们的照射下，细胞就死了。荧光显微镜是唯一可以看到活细胞的显微工具，比如观察病毒如何进攻细胞，药物怎样起作用，或者信使体怎样从一条神经跑到另一条神经那儿去。

黑尔说：“这种信使体藏在约40纳米大的小泡里，非常非常小，小泡们把信使体输送到神经细胞的一端，在那里抛而弃之，人们于是首次看到为此负责的某种蛋白质建立起一个模子来。”

在生物医学基础研究领域，科学家五分之四的分析是用荧光显微镜做的。对这种新的高分辨离率荧光显微镜的兴趣是巨大的。谁要想买一台，可以找曼海姆的莱卡显微系统公司，这种新显微镜由这家公司独家在全球销售，售价约合85万欧元。2007年秋，这种显微镜将形成系列。主要买家是德国和美国的顶尖科研机构。

马普所的新闻稿: 外链出处

这个idea是不错，如果不是阿贝的著名公式，这种idea可能还会早几十年出现。

另外，还有很多其他的办法可以突破衍射极限。著名的庄晓薇同学不久前也搞了一个随机光学重构显微镜，理论上分辨率可以直逼单分子极限。不过这些方法都依赖于各种次级效应，各自都有自己的限制，不再是原来的那种简单并行的直接成像了。

2006德国未来奖：超精细光显微镜

http://www.dw-world.de/dw/article/0,2144,2248485,00.html

Stimulated emission depletion microsocpy.

就是用受激发辐射把不想要部分的荧光激发态耗尽，

这样在测量时就看不到耗尽处发的荧光了。

具体做法是主聚焦点周围错开几个光点（有交叉

部分）耗尽荧光，这样

‘挤出’一块没有耗尽荧光的地方，就比常规聚焦点

小得多了。

难得有个懂行的人说一说。

不过最新的STED还应用了其他的几项新技术，一个是双镜头给光产生激光衍射，进一步缩小激发点；第二个法子是双光子激发，以此消除激发点外的衍射波纹；最后一项是双镜头同时取样，对激发出来的光线再来一次衍射，以此提高信号的信噪比。

不过说实话，这项技术的重要意义是在快速取样时可以提高分辨率，从而使得这项技术可以被广泛的应用。

给出几个数字，也让大家对于这项技术有点感性的了解吧：

肉眼的分辨率是200微米，也就是0.2毫米，这个数字是由我们的神经细胞的数目所决定的；再往下看，就需要仪器设备来辅助了。

光学显微镜的分辨率对于亮场可见光显微镜来说是500纳米，

对于普通的荧光显微镜来说是200-400纳米，

激光共聚焦显微镜的荧光分辨率为200纳米左右；

应用了双光子激活的共聚焦显微镜的荧光分辨率为100纳米左右。

暗场光学显微镜的分辨率也可以达到100纳米的级别。只不过这个技术只能分辨点、线。

而应用了最新技术的STED的分辨率可以达到50纳米以下。

这个数字，达到了一般的传统电子扫描显微镜的数量级，

低压电子扫描显微镜的分辨率已经可以达到5纳米，

核磁共振的分辨率并没有大家想象的那么高，对于一般的大分子，1.5纳米就是极限，通常的分辨率都在2.5纳米左右，

透射电子显微镜的分辨率在1纳米上下，

超高压透射电子显微镜的分辨率可以进一步提高到0.5纳米左右；

利用图像成像软件辅助的话，可以分辨到0.3纳米。这也是我们目前可以成像的的最大分辨率。

而我们人类最精细的物质分辨方式，X光晶体衍射的分辨率是0.1-0.05纳米。

几年前看到的paper 是4-pi 方法达到

纵向分辨率33 nm, 不知道这实际产品

是多少。

快速产生3D图像。我没见过实物，不知道具体如何。

衍射极限的技术看来发展前途远大，很有潜力。

Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission

Thomas A. Klar, Stefan Jakobs, Marcus Dyba, Alexander Egner, and Stefan W. Hell†

Max-Planck-Institute for Biophysical Chemistry, High Resolution Optical Microscopy Group, 37070 Göttingen, Germany

Edited by Daniel S. Chemla, E. O. Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA, and approved May 12, 2000

Received March 10, 2000.

Abstract

The diffraction barrier responsible for a finite focal spot size and limited resolution in far-field fluorescence microscopy has been fundamentally broken. This is accomplished by quenching excited organic molecules at the rim of the focal spot through stimulated emission. Along the optic axis, the spot size was reduced by up to 6 times beyond the diffraction barrier. The simultaneous 2-fold improvement in the radial direction rendered a nearly spherical fluorescence spot with a diameter of 90–110 nm. The spot volume of down to 0.67 attoliters is 18 times smaller than that of confocal microscopy, thus making our results also relevant to three-dimensional photochemistry and single molecule spectroscopy. Images of live cells reveal greater details.

比如单分子标记技术，与之相随的活细胞荧光染色技术，以及荧光显微镜的分辨率的进一步提高，都会在整体上提高我们对于细胞内部的了解。